上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的特殊條件

(1)防范微生物污染：

根據(jù)上皮組織分布的特性，位于體表或襯貼消化道、呼吸道內(nèi)等處的上皮組織，直接暴露或同外環(huán)境相接觸，組織本身帶有各種病原微生物或受其污染的機(jī)會(huì)較多。

要求在組織取材時(shí)就嚴(yán)格滅菌；

分離、種植、培養(yǎng)等諸多操作步驟上都要設(shè)法消除可能會(huì)出現(xiàn)的微生物污染。

培養(yǎng)中所使用的各種液體，包括細(xì)胞保存液、分離液以及培養(yǎng)基等需添加抗生素，抗生素濃度比其它組織培養(yǎng)高。

(2)生長(zhǎng)基質(zhì)的支持：

上皮細(xì)胞依賴貼附于某種支持物上才能生長(zhǎng)，即所謂的貼壁依賴性細(xì)胞。

在培養(yǎng)器皿表面包被生長(zhǎng)基質(zhì)，如膠原或其它細(xì)胞外基質(zhì)成分等，模擬體內(nèi)的基膜結(jié)構(gòu)，不僅特別有利于上皮細(xì)胞的貼附和生長(zhǎng)，也有利于培養(yǎng)細(xì)胞的分化．使細(xì)胞極性表現(xiàn)更為明顯。

(3)特殊的培養(yǎng)基：

培養(yǎng)基有M199、RPMl 1640、DMEM和HamFl2。

其中以M199和RPMl 1640較為常用。

M199和RPMI1640培養(yǎng)基僅適用于上皮組織的短期培養(yǎng)和維持其生存，對(duì)上皮組織的長(zhǎng)期培養(yǎng)和促增殖作用并不明顯。

DMEM和HamFl2培養(yǎng)基用于上皮組織培養(yǎng)時(shí)有其特殊作用。

可促進(jìn)上皮細(xì)胞的貼附；

維持上皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)狀態(tài)的分化。

HamFl2培養(yǎng)基的特殊性

特別適用原代上皮細(xì)胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分中添加微量元素的無機(jī)離子，更加利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝。

在實(shí)際培養(yǎng)時(shí)，將DMEM與HamFl2按一定比例混合用于上皮組織培養(yǎng)。

加入血清，但出廠血清成分復(fù)雜，含有一定量的有毒物和抑制物。

(4)去除成纖維細(xì)胞：

上皮組織借薄層基膜和結(jié)締組織相連。

取材分離細(xì)胞時(shí)會(huì)帶入少量結(jié)締組織成分，常常造成成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞混和生長(zhǎng)。由于成纖維細(xì)胞具有增殖能力和粘附能力強(qiáng)的特點(diǎn)，很容易“瘋長(zhǎng)"為培養(yǎng)物中的優(yōu)勢(shì)細(xì)胞群，從而干擾或抑制上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，成為上皮細(xì)胞的“細(xì)胞污染源"。

因在上皮細(xì)胞的取材、分離、種植和傳代的培養(yǎng)過程中，要特別注意上皮細(xì)胞的純化，去除和抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)。

內(nèi)皮細(xì)胞：

來源：人臍帶臍靜脈，動(dòng)物動(dòng)脈

消化：用膠原酶比胰蛋白酶消化好。

但要注意掌握消化時(shí)間和雜細(xì)胞（成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞）。

內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定

用免疫組化染色檢測(cè)VIII因子相關(guān)抗原和CD34抗原, 鑒定內(nèi)皮細(xì)胞。

觀察細(xì)胞是否呈單層貼壁生長(zhǎng), 細(xì)胞形態(tài)，如長(zhǎng)梭形、多角形三角形、四邊形為主, 呈典型的“鋪路石"樣征象 ；

觀察第三代細(xì)胞純度是否達(dá)95%以上。

如消化時(shí)間過長(zhǎng)或操作不慎、刮取過重時(shí)，會(huì)造成血管內(nèi)皮下層與外膜成纖維細(xì)胞以及中膜平滑肌細(xì)胞污染。由于這些雜細(xì)胞生長(zhǎng)較快，隨著傳代次數(shù)越多，其污染的程度越重，從而使培養(yǎng)失敗。

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